NY∕T 1898-2010 畜禽线粒体DNA遗传多样性检测技术规程(农业)
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ID： |
314DB64470654E43A1369FD432A9F65F |
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文件大小(MB)： |
0.98 |
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页数： |
9 |
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文件格式： |
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日期： |
2021-12-20 |
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ICS 65.020.30,B 43,中华人民共和国农业行业标准,NY/ T 1898一2010,禽线粒体DNA遗传多样性,检测技术规程,Protocolof detection for mitochondrial DNA genetic diversity,of domestic animals,2010-07-08 发布2010-09-01 实施,中华人民共和国农业部发布,前,--E,本标准遵照GB/T 1. }-2009 给出的规则起草a,本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出,本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/ TC274) 归口,本标准起草单位:全国畜牧总站,本标准主要起草人: 王志刚、刘丑生、邱小田、张桂香、韩旭、于福清、孙飞舟,NY/T 1898-2010,I,畜禽线粒体DNA 遗传多样性检测技术规程,1 范固,本标准规定了畜禽线粒体DNA 遗传多样性检测的技术规程,本标准适用于畜禽线粒体DNA 遗传多样性检测.,2 规范性引用文件,NY/T 1898-2010,下列文件对于本文本的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文,件. 凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单〉适用于本文件.,GA/T 383 法庭科学DNA 实验室检验规范,NY/ T 1673 畜禽微卫星DNA 遗传多样性检测技术规程,3 术语和定义,下列术语、定义和缩略语适用于本文件.,3. 1,线粒体DNA mitochondrial DNA. mtDNA,动物细胞核外唯一具有半自主能力的双链环状DNA o,3. 2,线粒体DNA D- Joop 区mt J)NA D - Joop,动物线粒体DNA 翻译和转录的调控区和唯一的非编码区，当线粒体DNA 开始复制时，此区外形,呈D 形.,4 检测方法,4 1 样品的采集和保存,4. 1. 1 在中心产区采样，个体应具备该种群的典型特征，样品的采集及保存应满足提取DNA 的要求,并详细记录材料名称、来源、系谱、采集时间、地点及保存条件,4. 1. 2 每种群采集畜禽个体一般不少于60 头(只) .其中雄性数量不少于10 % ，要求个体间三代内元,血缘关系.,4.2 DNA 的制备,制备DNA 的方法按NY/ T 1673 的规定执行.,4.3 引物制备,4. 3. 1 引导'合成,根据相关畜禽线粒体基因组序列设计引物，并合成.,4. 3. 2 工作液配制,将合成的引物瞬时离心， 加入灭菌超纯7k充分震荡，配成浓度为100 pmoI! μL 的储液，室温溶解30,ffiln ，分装， 一20 'C保存，储液稀释10 倍即为工作液.,其中加入灭菌超纯水的体积v(μ L)按式(])计算,v = 笠兰旦主羊且1 (1) A机再r,NY/ T 1898一2010,式中z,MW一-引物分子量;,OD ONA260 nm 吸收的光密度,4.4 PCR 反应体系,PCR 反应体系见附录A. 10,4.5 PCR 反应程序,PCR 反应程序见附录A.2 0,4.6 扩增产物的检测与国收,凝胶电泳法检测PCR 产物，扩增效果良好的样品按附录B 纯化回收，按附录C 测序.,5 搬据分析,序列比对、单倍型统计、系统发生树构建等数据分析参见附录00,6 防污染措施,按GA/ T 383 规定的方法执行,7 对照实验,设立阳性对照、阴性对照和空白对照，阳性对照为线粒体ONA 样品，阴性对照为不具有细胞核[,ONA 样品，空白对照为等量双蒸水,2,A. l PCR 反应体系见襄A. 1,组分及浓度,Buffer(lOX ),MgCl, (25 mmol! L),引物I' I AOO pmo l/ μL),弓l 物I' I BO O pmo l! μu,d!'1TPs( 10 mmol! L),Taq E(5 u/ μu,DNA 样品,ddH,O,A. 2 陀R 反应程序见褒A. 2,阶段,预变性,2 5 个- 3 5 个循环,延伸,保存,附录A,(规范性附录),PCR 反应体系和程序,表A. l PCR 反应体系,5. 0 μL,l 严L-4 μL,2. 0 pL,2.0 μL,I μL,O. 2 p.L,50 ng-- l 00 ng,JJu至5 0 μL,表A . 2 PCR 反应程序,温度. 'C,95,94,50-65,72,使用,72'C 10 min--70 min,4'C,NY!T 1898-2010,最,问,4 min,20 s.60 s,30 ,- 60 ,305.90 s,3,NY!T 1898-2010,B. 1 材料、试剂和仪器,B. 1. 1 材料,待回收DNA 样品,B 1.2试剂,a) 1 %低熔点胶，琼脂糖;,附录B,{资料性附录),扩增产物的纯化回收,b) glassmilk kit 裂解缓冲液，漂洗液， glassmilk;,c) TE.ddH20;,d) 盼:分析纯;,e) 氯仿:分析纯s,0 元水乙醇:分析纯;,g) 70% 乙醇z 分析纯,B. 1.3 仪器设备,a) 离心机;,b) 71<浴锅;,c) 电泳仪.,B.2 纯化回收程序,B 2. 1 低熔点肢法,电泳到适当位置后，在目的DNA 条带的前端挖一长方形槽，向槽中加入融化的低熔点胶，待凝固,后进行电泳.当DNA 进入低熔点胶中心时停止电泳. 紫外灯下切下目的条带的低熔点胶。将切下的,胶放到离心管中，加入200 μL 的TE. 65 'C 温浴3 mi n 以融化低熔点胶.分别用酷/ 氯仿和氯仿抽提一,次。取上清液，加入2 倍体积的……
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